失眠克隆猴背后：中国是唯一掌握该技术国家 加码攻克脑疾病

2018年1月25日，中科院神经科学研究所克隆猴成果以封面文章的形式发表在《细胞》（Cell）杂志。“中中”和“华华”让中国体细胞克隆技术首次领跑世界。一年之后，中国的研究团队不仅依然保持着该技术的领先，还将优势进一步扩大。

《国家科学评论》（National Science Review）封面 中科院神经科学研究所 图

北京时间1月24日，于2013年创刊的中国顶级综合英文期刊《国家科学评论》（National Science Review）在线发表了两篇体细胞克隆疾病猕猴模型相关研究成果。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心团队利用体细胞核移植技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建5只体细胞BMAL1基因敲除的生物节律紊乱猕猴模型。

这是研究团队在一年前体细胞克隆猴成果上的进一步延伸，也是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。此前研究已表明，生物节律紊乱与睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默症）、精神疾病（如抑郁症）、糖尿病、肿瘤，以及心血管疾病等密切相关。

中科院神经所在一份新闻稿中表示，该成果表明中国正式开启了批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代，为脑认知功能研究、重大疾病早期诊断与干预、药物研发等提供新型高效的动物模型；该成果的应用有助于缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，必将极大地促进生命科学和医学的发展，加快我国新药创制与研发的进程。

中国仍是目前唯一拥有克隆猴技术的国家

克隆猴所用的技术，为体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，简称“SCNT”）。

1997年2月，英国Roslin研究所伊恩 维尔穆特（Ian Wilmut）教授率领的团队在顶级学术期刊《自然》（Science）公布了“多莉”羊的诞生，彻底颠覆了人类对生殖发育经典理论的认识。

“多莉”诞生之后，全球多个实验室陆续攻克了超过20种哺乳动物的克隆。但直到2018年1月25日，和人类最为接近的灵长类动物食蟹猴才最终在中国诞生。而在近20年之前，无数次试验之后，用克隆技术实现克隆猴一度被世界顶级科学家宣判“行不通的”。

克隆技术原理并不复杂，研究人员将一种体细胞培养后注入去除遗传物质的卵子，通过人工方法激活后再移植到代孕母体发育成个体。

但核心在于，如何让已经高度分化的体细胞重新变回分化前的状态，这种类似“时光逆转”的反自然过程被称为“重编程”。中国科学院院士季维智在接受澎湃新闻采访时曾表示，“克隆难点就在于体细胞，科学家要解决的一个基本的科学问题就是，如何把高度分化的细胞变成多能性，具备像精子一样的功能。”

另外，和其他哺乳动物相比，在克隆猴过程中还存在着更为艰巨的问题。首先是细胞核不易识别，“去核”难度大。另外，体细胞克隆胚胎的发育效率低，绝大多数克隆胚胎都难以正常发育，往往胎死腹中。

最终，中科院神经科学研究所孙强、蒲慕明领导的研究团队历时5年攻克了这项世界第一。论文第一作者、彼时尚为研究生的刘真耗时3年训练了快速“去核”、“注核”的本事。在蒲慕明和孙强的眼里，就细胞“去核”、“注核”技术，刘真是当之无愧的“世界冠军”。

此外，研究团队经过无数次尝试，找到体细胞去甲基化、乙酰化的“合适配方”。体细胞甲基化、乙酰化实际上都是体细胞重编程过程中的表观遗传修饰障碍。无论DNA、RNA还是蛋白质，其表面均有例如甲基、乙酰基等的额外基团，这些基团就被称为“修饰”，它们受细胞状态影响，也能反过来影响细胞状态。

去甲基化、乙酰化可使得重编程效率大大增加。而在孙强率领的团队之前，华裔科学家、美国哈佛医学院教授张毅实验室，上海同济大学高绍荣团队都在搬掉这道“障碍”方面进行深入研究，成为克隆猴成功的“垫脚石”之一。

值得一提的是，在一年前克隆猴成果发布之时，蒲慕明曾表示，中国只比国外领先一年。“留给我们的时间只有一年，怎么样抓住这样的机遇，快速做出几个疾病的动物模型，去申请专利，这是我们面临的挑战之一。”

然而，从目前公开信息来看，中国仍是掌握克隆猴技术的唯一国家。

此外，这次的成果还有力回应了另一个“擦边球”问题。在“中中”、“华华”问世之时，外界曾质疑，使用流产胎猴的细胞让克隆成功打上了一定的“折扣”，但此番却是实实在在从成年猴身上去下皮肤细胞进行克隆。

“现在我们可以明确回应，体细胞克隆猴是可行的，而且还可以发展成遗传背景完全一致的疾病模型。”蒲慕明表示。

克隆、基因编辑两项技术构建理想疾病模型

克隆猴诞生之后，孙强等人这次的最新成果只是时间问题。

早在克隆猴成果发布之后，国内多名学者在接受澎湃新闻采访时即提到，“未来的方向就是将克隆技术和基因编辑技术结合起来构建动物的疾病模型。”蒲慕明也表示，“完成体细胞克隆猴只是第一步，我们的最终目的是获得各种品系的疾病模型猴。”

蒲慕明此前也透露，正在研究带“病”的克隆猴，通过基因编辑技术改变克隆猴的基因，让它天生带病，避免了因遗传背景患病的因素，从而更好地进行医药研究。在2018年初召开的2018年腾讯WE大会上，蒲慕明还提到，“我认为今年的进展比原来创造出克隆猴更重要。 现在我们又领先了，大家等新闻吧！”

实际上，单单利用编辑技术构建动物疾病模型已不是新研究，但获得的模型并不理想。中科院神经所就提到，通过基因敲除方法获得的第一代（F0）模型猴个体间存在遗传背景和基因编辑嵌合率差异，所获得的5只BMAL1敲除猴表现出上述症状的严重程度不一致，因此不能作为理想的动物模型。

值得一提的是，嵌合突变和脱靶问题一直是基因编辑技术的两大主要问题。大部分经过基因编辑的动物都有嵌合性，也就是说只有一部分细胞的基因发生了编辑。对于涉及表型的研究而言，嵌合的基因编辑动物需要进一步地杂交育种获得F1代，才能得到完全的基因敲除动物。当涉及到非人灵长类猴子时，嵌合体的问题就会显得更为严重，因为猴子的繁殖周期长达5-6年，而且每胎只生一个幼崽。

2016年，孙强等人率领的研究团队利用基因编辑技术开始了建立疾病模型猴的探索。他们敲除了5只猕猴胚胎中的生物节律基因BMAL1，其中的三只基因敲除完全，而编号A6的公猴症状表现最为明显。

这只A6随后就被用来“拔毛变猴”。研究团队从A6猴身上取下皮肤细胞，将325个体细胞核移植胚胎移植到65个代孕猴体内，最终获得5只与供体成纤维细胞核基因相同的BMAL1基因敲除，即生物节律紊乱的疾病模型猴。这5只疾病模型猴在半年内陆续出生，编号从B1到B5。目前年龄最大的已超半岁，年龄最小的也已超过3个月。

5只体细胞BMAL1基因敲除的生物节律紊乱猕猴 中科院神经科学研究所 图

基因检测结果表明，这5只猕猴模型的核基因全部来源于供体猕猴成纤维细胞，线粒体基因则来源于供体卵母细胞。并且猕猴模型具有BMAL1双等位基因突变，无嵌合体；经外周血mRNA分析确认，完全没有野生型BMAL1转录组存在，证明猕猴模型体内BMAL1表达缺失。

最终获得的这5只BMAL1敲除猕猴表现出较高的夜间运动、睡眠障碍、焦虑、抑郁和精神分裂症等表型，转录组数据分析也表明其与炎症、睡眠障碍、抑郁等相关的基因表达水平显著上调。

这也意味着，它们将成为研究生物节律紊乱相关疾病机理和治疗方法理想的动物模型。同时，与其他动物模型相比，非人灵长类动物模型与人类的生物节律、代谢等方面更接近。

中国的“杰克逊实验室”

遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型的成功构建，理论上意味多种稳定品系的疾病模型猴的构建皆指日可待。而这或将使得中国将成为全球实验猴的最大供应商。

一年之前，蒲慕明就说过，世界上最著名的模式动物研发、销售公司是美国的Jackson Laboratory（杰克逊实验室）公司。该公司成立于1929年，出售7000多种基因编辑小鼠。“克隆猴技术将造就一个中国的Jackson Laboratory。”

蒲慕明认为，中国对体细胞克隆猴技术的突破即进一步巩固了中国科学家在国际大科学计划，如脑图谱计划中的主导地位。“（海外）你想用某个疾病的克隆猴模型，可以，我们不出口，要用的话，来上海用！”

蒲慕明此番提到，未来，位于上海松江区的G60脑智科创基地将在全球率先建立实验猴供应平台，发展疾病模型猴的稳定品系，由此发展起脑疾病诊断、药物检测及干预等一系列研发与产业化项目。

此前的2018年7月18日上午，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心和上海市松江区人民政府签署相关投资框架协议，G60脑智科创基地在松江成立，并揭牌成立中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（上海松江）和上海脑科学与类脑研究中心（松江基地）。

据悉，多支国际科研团队将全职入驻G60脑智科创基地，围绕包括克隆猴在内的非人灵长类模型开展前沿研究。

值得一提的是，在1月23日于区G60脑智科创基地召开的“生物节律紊乱体细胞克隆猴模型新闻发布会”现场，中科院神经所还与中科院上海药物研究所签订了战略合作协议，双方将共同开发用于新药研发的疾病猴模型。

蒲慕明认为，人类很多与神经系统相关的疾病，如阿尔茨海默症、自闭症、心脑血管疾病等，很难通过小鼠来模拟。“没有猴子作为实验动物模型，神经科学很难有实质性推进。”而遗传背景一致的实验用疾病模型猴或将加大药物研发的成功概率。

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